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Após derrotar o Duende Verde a vida de Peter Parker (Tobey Maguire) muda por completo. Temendo que Mary Jane (Kirsten Dunst) sofra algum risco por ser ele o Homem-Aranha, Peter continua escondendo o amor que sente e se mantém longe dela. Ao mesmo tempo precisa lidar com Harry (James Franco), seu melhor amigo, cuja raiva pelo Homem-Aranha aumenta cada vez mais por considerá-lo como sendo o assassino de seu pai. Além disso sua tia May (Rosemary Harris) passa por uma fase difícil após a morte de seu tio Ben, estranhando também o comportamento do sobrinho. Enquanto precisa lidar com seus problemas particulares Peter recebe ainda uma má notícia: o surgimento do Dr. Octopus (Alfred Molina), um homem que possui tentáculos presos ao corpo.